Guia do comprador Tecnologia PCR
A tecnologia de reação em cadeia da polimerase (PCR) é um elemento básico de inúmeros laboratórios de pesquisa e testes, em uma variedade de campos, incluindo biomedicina, diagnósticos clínicos, testes de microbiologia de alimentos e forense criminal. Essa tecnologia fundamental usa ciclos térmicos para facilitar uma série de reações nas quais uma amostra de DNA é replicada rápida e exponencialmente para produzir milhões ou bilhões de cópias de sequência. Ao adquirir um novo sistema de PCR, é importante considerar os objetivos finais de sua aplicação, a precisão e a eficiência do equipamento de ciclagem térmica e a capacidade e flexibilidade do instrumento. Este artigo fornece uma visão geral das diferentes opções e recursos disponíveis para sistemas de PCR para ajudar a selecionar um sistema adequado para sua aplicação.
1. PCR vs. qPCR vs. dPCR
Embora todos os sistemas de PCR repliquem o DNA usando a reação em cadeia da polimerase, existem diferentes metodologias usadas por diferentes sistemas para obter resultados específicos. Entre esses diferentes métodos estão PCR padrão, PCR quantitativo (qPCR) e PCR digital (dPCR).
Máquinas de PCR padrão são normalmente usadas para amplificar o DNA para testes posteriores e uso; em certo sentido, essa tecnologia é usada como um meio para gerar um produto final, e não como um método de teste analítico em si. O DNA amplificado pode ser medido somente após a reação de PCR se completa, em vez de em tempo real e, portanto, esse método é às vezes referido como PCR de ponto final. O produto final da amplificação por PCR tradicional é comumente usado para clonagem e sequenciamento downstream, e também pode ser verificado usando eletroforese em gel para confirmar a presença de sequências-alvo e sua quantidade relativa em baixa resolução (com base na intensidade da banda).
Para uma quantificação mais rápida e precisa da quantidade de sequência alvo presente em uma amostra, a PCR quantitativa (qPCR), também conhecida como PCR em tempo real, usa sondas fluorescentes durante o processo de amplificação para monitorar a quantidade de DNA presente após cada ciclo térmico. Ao observar quantos ciclos são necessários para atingir um determinado limite de intensidade de fluorescência, o analista pode determinar a quantidade de DNA no material inicial ao comparar os resultados com uma curva padrão. A qPCR também pode confirmar a presença ou ausência de uma sequência alvo mais rapidamente do que a PCR de ponto final e, portanto, é usada em aplicações de diagnóstico, como a detecção de SARS-CoV-2 (usando a transcrição reversa para primeiro converter o RNA viral em cDNA).
A PCR digital (dPCR) é outro método quantitativo no qual as reações de PCR ocorrem em milhares de câmaras de reação separadas, e o número absoluto de moléculas de DNA na amostra original pode ser determinado com base em quantas câmaras de reação produzem um sinal fluorescente após a amplificação ser concluída . Ao contrário do qPCR, as medições fluorescentes não são realizadas em tempo real e não é necessária uma curva padrão para quantificar o DNA na amostra. Embora o dPCR normalmente tenha um rendimento limitado e custos mais altos do que o qPCR, ele é mais preciso, sensível e preciso na quantificação do DNA e é especialmente útil em aplicações como a detecção de mutações raras e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs).
A determinação de escolher PCR de ponto final (qualitativo/semiquantitativo) versus um método quantitativo (qPCR ou dPCR) é relativamente direta quando você considera sua aplicação, mas a escolha entre qPCR e dPCR pode ser mais sutil. A qPCR é de alto rendimento, econômica e suficientemente sensível para muitas aplicações, mas a dPCR pode ser uma escolha melhor se a quantificação absoluta com baixos limites de detecção for fundamental.
2. A importância do controle de temperatura
A capacidade dos termocicladores de ajustar e controlar com precisão e eficiência a temperatura das amostras é o que permite o sucesso das reações de amplificação e deve ser o foco central da seleção de qualquer sistema de PCR. Diferentes sistemas podem oferecer diferentes capacidades em relação a taxas de rampa, uniformidade e precisão de temperatura e a capacidade de atingir gradientes de temperatura em blocos térmicos para auxiliar na otimização do método de PCR.
A taxa de rampa refere-se à velocidade das mudanças de temperatura entre as etapas do ciclo térmico e é normalmente expressa em graus Celsius por segundo (°C/seg) nas especificações do instrumento. Os fabricantes podem fornecer informações sobre taxas de rampa máximas e taxas médias de rampa, bem como diferenciar entre as taxas de rampa ascendente (aquecimento) e as taxas de rampa descendente (resfriamento) de um instrumento. Em geral, taxas de rampa mais altas correspondem a tempos de execução mais rápidos, mas os compradores devem ter cuidado ao focar nas taxas de rampa máximas sem examinar outras métricas relacionadas à velocidade do instrumento. Um instrumento pode atingir sua taxa de rampa mais alta apenas por um curto período de tempo, e a taxa de rampa média refletirá melhor o ritmo das mudanças de temperatura. Embora as especificações da taxa de rampa possam dar uma ideia geral de quão rápido certos instrumentos podem funcionar, quando possível,
A precisão e a uniformidade da temperatura também são essenciais para reações bem-sucedidas e, embora todos os termocicladores sejam projetados para produzir as temperaturas necessárias para PCR, certos recursos podem oferecer um maior grau de confiança, o que é crítico para aplicações nas quais as amostras podem ser limitadas e os resultados confiáveis são primordial, como em diagnósticos clínicos e forenses. O controle preciso da temperatura também é crucial ao usar a máquina de PCR para técnicas sensíveis, como análise de fusão de alta resolução (HRM). Uma tampa aquecida pode garantir uma melhor uniformidade de temperatura em todo o tubo de PCR, pois sem uma tampa aquecida, a amostra pode evaporar e condensar no topo do tubo onde a temperatura é mais baixa. O design do bloco térmico também afeta o controle de temperatura; blocos de alumínio são a opção mais econômica, mas são os menos condutores, o que significa que eles atingirão a uniformidade de temperatura mais lentamente e terão taxas de rampa mais baixas do que blocos mais condutores. Blocos revestidos de prata e ouro são mais caros, mas permitem que a transferência de calor ocorra mais rapidamente, garantindo uma distribuição de temperatura uniforme em todo o bloco.
Diferentes alvos de DNA podem exigir diferentes temperaturas para alcançar os melhores resultados de amplificação; por exemplo, sequências ricas em GC precisam de temperaturas mais altas para desnaturação. As temperaturas ideais de recozimento também são afetadas por uma série de fatores - embora as temperaturas para esta etapa sejam geralmente selecionadas com base nas temperaturas de fusão dos primers, as diferenças nas temperaturas de fusão entre os pares de primers e a influência da concentração do reagente, pH e concentração de sal podem tornam a otimização das condições de temperatura de reação uma tarefa complicada. As máquinas de PCR com habilidades de gradiente de temperatura são projetadas para auxiliar na otimização dos métodos de PCR, permitindo que várias temperaturas de recozimento sejam testadas em uma única execução. Dependendo dos tipos e da diversidade de amostras que você planeja analisar usando sua máquina de PCR,
3. Blocos Térmicos
Conforme mencionado, o bloco térmico usado com um instrumento de PCR pode fazer a diferença no controle de temperatura, mas o design do bloco – e o design do instrumento para acomodar diferentes blocos – também afeta o rendimento, os custos de consumíveis e a flexibilidade. Os blocos típicos virão em formato de 96 poços ou 384 poços, embora também estejam disponíveis outros formatos, como 48 poços e 1536 poços. Uma maior contagem de poços permite maior rendimento com menores volumes de reação, o que inicialmente será mais caro, mas no final reduz o preço por reação devido ao menor volume de reagente usado para cada poço. Considerando quantas amostras você estará processando e com que frequência você usará a máquina, determinará se um bloco térmico de contagem de poços menor ou maior será mais prático e econômico para o seu laboratório.
Alguns instrumentos vêm com um formato de bloco fixo, enquanto outros permitem o uso de blocos intercambiáveis, oferecendo mais flexibilidade para alternar entre os formatos de 96 e 384 poços ou entre diferentes materiais de bloco para diferentes aplicações. Alguns termocicladores também acomodam vários blocos no mesmo instrumento, permitindo que diferentes protocolos sejam executados em diferentes conjuntos de amostras ao mesmo tempo.3 Blocos com dimensões “universais” aumentam ainda mais a flexibilidade para usar tubos, tiras ou placas de PCR de tamanhos diferentes, conforme necessário .
Devido ao papel fundamental deste componente no controle de temperatura, manuseio de amostras e rendimento, as opções de bloqueio térmico devem ser cuidadosamente consideradas ao selecionar um termociclador. Para laboratórios com um baixo volume de amostras, ou aqueles que rotineiramente executam apenas um punhado de ensaios, instrumentos de bloco fixo de baixo custo com um formato padrão de 96 poços podem ser suficientes. No entanto, instrumentos modulares e flexíveis podem ser vantajosos para laboratórios com um número maior de protocolos, volumes de amostra variados e mais usuários que dependem do mesmo instrumento para seus próprios ensaios, bem como laboratórios que desejam expandir sua capacidade de produção no futuro.